Cette comédie en cinq actes et en vers explore les méandres et les quiproquos de l'amour. L'intrigue principale tourne autour d'Éraste, amoureux de Lucile, qui la croit infidèle avec Valère. Pendant ce temps, Ascagne, fille déguisée en homme depuis l'enfance pour des raisons d'héritage, aime secrètement Valère et a réussi à se faire passer pour Lucile auprès de lui lors de rendez-vous nocturnes. Un réseau de mensonges, de déguisements et de fausses promesses s'embrouille jusqu'à ce que toutes les vérités soient révélées lors d'un dénouement complexe où les couples se forment enfin selon leurs véritables sentiments.
Éraste exprime ses doutes à son valet Gros-René sur la fidélité de Lucile, qu'il soupçonne d'être amoureuse de Valère. Marinette, la suivante de Lucile, apporte un billet d'amour d'elle à Éraste, lui demandant d'obtenir le consentement de son père Albert. Mascarille, valet de Valère, révèle à Éraste que son maître et Lucile sont secrètement mariés. Furieux, Éraste et Gros-René repoussent violemment Marinette lorsqu'elle revient avec un nouveau message de sa maîtresse.
"Veux-tu que je te dise ? Une atteinte secrète / Ne laisse point mon âme en une bonne assiette."
"Sous ce faux semblant, qui trompe tout le monde, / En vous trompant aussi, leur ardeur sans seconde / D'un secret mariage a serré le lien."
Ascagne révèle à sa confidente Frosine qu'elle est une fille déguisée en garçon depuis l'enfance pour des questions d'héritage. Elle lui avoue aussi qu'elle aime Valère et a réussi, en se faisant passer pour sa sœur Lucile lors de rendez-vous nocturnes, à le convaincre de l'épouser secrètement. Lucile, piquée par le mépris d'Éraste, annonce qu'elle va aimer Valère pour se venger. Une scène comique oppose Albert, qui veut s'informer de son fils Ascagne, au pédant Métaphraste, incapable de répondre simplement.
"Sachez donc que l'amour ne sait point s'abuser ; / Que mon sexe à ses yeux n'a pu se déguiser."
"Mon Dieu, Maître éternel, laissez là, je vous prie, / Les Grecs, les Albanais, avec l'Esclavonie, / Et tous ces autres gens dont vous venez parler."
Mascarille, craignant les conséquences de ses mensonges, décide d'aller tout avouer au père de Valère, Polydore. Il rencontre d'abord Albert. Polydore arrive ensuite et, dans un grand quiproquo où chacun croit que l'autre parle de la même faute, ils se pardonnent mutuellement avant de comprendre qu'ils ne parlent pas de la même chose : Polydore parle du prétendu mariage de son fils avec Lucile, tandis qu'Albert pense que Polydore a découvert son propre secret (avoir substitué Ascagne à son fils défunt pour garder un héritage). Valère, grondé par son père, s'en prend à Mascarille. Une confrontation entre Albert, Valère, Mascarille et Lucile tourne à la confusion totale, Lucile niant farouchement tout mariage secret.
"Grâce, au nom de Dieu, grâce, ô seigneur Polydore."
"Eh ! C'est moi qui de vous présentement l'implore."
Ascagne s'inquiète des conséquences de ses mensonges. Éraste et Lucile, chacun persuadé d'avoir été méprisé, se rencontrent et décident solennellement de rompre, en se rendant mutuellement lettres et cadeaux. La passion reprend vite le dessus et ils se réconcilient. La scène est parodiée par leurs valets, Gros-René et Marinette, qui reproduisent la même querelle puis le même raccommodement, de façon plus grotesque.
"Voici votre portrait... il cache sous eux cent défauts aussi grands, / Et c'est un imposteur enfin que je vous rends."
"Il faut rompre la paille : une paille rompue / Rend, entre gens d'honneur, une affaire conclue."
Valère veut aller trouver Lucile de nuit, ce qui effraie Mascarille. Frosine révèle à Ascagne la vérité sur sa naissance : elle est bien la fille d'Albert, qui avait substitué un garçon (le fils d'Ignès) à sa propre fille. À la mort de ce garçon, Albert a fait passer sa fille (Ascagne) pour son fils. Polydore annonce à Valère qu'il doit se battre en duel avec Ascagne. Tous se réunissent. Polydore et Albert révèlent alors la vérité : Ascagne est une femme nommée Dorothée, et c'est elle que Valère a épousée secrètement en croyant parler à Lucile. Tous les malentendus sont levés : Valère est heureux d'épouser Dorothée/Ascagne, et Éraste obtient la main de Lucile. Les valets envisagent leur propre mariage, non sans jalousie comique.
"Celle à qui par serment ton âme est attachée, / Sous l'habit que tu vois à tes yeux est cachée."
"De l'humeur que je sais la chère Marinette, / L'hymen ne ferme pas la porte à la fleurette."
Jeune homme épris de Lucile. Passionné mais jaloux et prompt à la colère, il est le moteur du « dépit amoureux » qui donne son titre à la pièce.
PrincipalFille d'Albert. Fière et vive, elle est aimée d'Éraste et de Valère. Elle use de feinte indifférence et annonce aimer Valère par dépit pour piquer Éraste.
PrincipalFils de Polydore. Amoureux de Lucile, il est en réalité tombé amoureux d'Ascagne qui se faisait passer pour elle. Il apparaît d'abord comme un rival serein, puis comme une victime du stratagème.
PrincipalFille d'Albert, déguisée en garçon depuis l'enfance pour des raisons d'héritage. Rusée et amoureuse de Valère, elle est l'architecte principale des quiproquos amoureux en se faisant passer pour Lucile auprès de lui.
PrincipalPère de Lucile et d'Ascagne. Vieillard inquiet qui a monté la supercherie du déguisement de sa fille pour conserver un héritage. Il est facilement irritable, notamment face au pédant Métaphraste.
PrincipalPère de Valère. Homme raisonnable et conciliant, il cherche à arranger les affaires de son fils et finit par révéler la vérité.
PrincipalValet de Valère. Fourbe, menteur, lâche mais aussi plein d'esprit. Ses révélations mensongères et ses manigances sont à l'origine d'une grande partie des conflits, mais il cherche aussi à s'en sortir par la ruse.
PrincipalValet d'Éraste. Personnage jovial, terre-à-terre, peu porté aux tourments de la jalousie. Il forme avec Marinette un couple de valets qui parodie les amours de leurs maîtres.
PrincipalSuivante de Lucile. Espiègle et intéressée (elle réclame une bague à Éraste), elle est la complice de sa maîtresse et l'amante de Gros-René.
PrincipalConfidente d'Ascagne. Elle est la seule à connaître son secret dès le début et lui sert de conseillère.
SecondairePédant, précepteur d'Ascagne. Personnage comique qui ne peut s'empêcher de citer du latin et des auteurs antiques à tout propos, au grand agacement d'Albert.
SecondaireBretteur, ami de Valère. Il offre ses services pour un éventuel duel, contribuant à l'atmosphère de confrontation.
Mineur